Phát hiện Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) trong tôm bằng công nghệ PCR

Phát hiện Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) trong tôm bằng công nghệ PCR 

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) là một loài vi bào tử nhóm microsporidian đã gây ra những tác động nghiêm trọng đến ngành nuôi tôm toàn cầu. EHP được phát hiện đầu tiên trên tôm ở Thái Lan và sau đó lan rộng đến nhiều khu vực nuôi tôm khác, bao gồm các quốc gia trong khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ, và nhiều nước ở Nam Mỹ.

EHP gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng trong nuôi tôm, đặc biệt là hạn chế tốc độ tăng trưởng, do vi khuẩn này ký sinh trong tế bào gan tuyến của tôm. Việc phát hiện EHP kịp thời và chính xác đóng vai trò quan trọng trong phòng ngừa và kiểm soát bệnh trong ao nuôi tôm.

PCR là gì?

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi để khuếch đại một phân đoạn ADN đặc hiệu. Kỳ thuật PCR có độ nhạy cao và độ chính xác vượt trội, giúp phát hiện ngay cả khi chỉ có lượng ADN rất nhỏ trong mẫu.

Trong ngành nuôi tôm, PCR được sử dụng để phát hiện nhiều loại mầm bệnh, bao gồm virus và vi khuẩn. Đối với EHP, PCR là một công cụ đắc biệt hữu hiệu nhờ khả năng phát hiện ADN của vi khuẩn trong mẫu sinh học.

Tầm quan trọng của việc phát hiện EHP

Phát hiện sớm:

PCR giúp xác định sự hiện diện của EHP trước khi tôm có biểu hiện bênh lý.

Hạn chế lan trần:

Việc phát hiện sớm cho phép các biện pháp phòng ngừa và xử lý ao nuôi được thực hiện nhanh chóng, ngăn chặn bệnh lây lan sang các ao khác.

Giảm thiệt hại kinh tế:

Nhờ phát hiện và kiểm soát bệnh kịp thời, người nuôi tôm có thể giảm thiệt hại về năng suất và chi phí.

Quy trình sử dụng PCR để phát hiện EHP

Thu thập mẫu

Nguồn mẫu: Mẫu tôm được lấy từ gan tuyến (hepatopancreas), do đây là cơ quan chính bị ký sinh bởi EHP.

Kỹ thuật lấy mẫu: Sử dụng dụng cụ vô trùng để tránh lây nhiễm chéo. Sau khi lấy mẫu, bảo quản trong dung dịch lắm màu (như ethanol 70%) hoặc đông lạnh tức thời.

Chiết tách ADN

Chuẩn bị ADN: Sử dụng bộ kit chiết tách ADN thương mại hoặc quy trình thông thường như phenol-chloroform.

Yêu cầu ADN: ADN chiết tách phải đạt độ sạch và không bị phân hủy để đảm bảo kết quả PCR chính xác.

Chuẩn bị phản ứng PCR

Thành phần cần thiết:

ADN mẫu.

Mỗi dẫn đặc hiệu (đoạn primer) cho EHP.

Taq polymerase.

Dung dịch đệm (buffer).

Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).

Cách chọn primer: Primer đặc hiệu cho EHP phải nhận biết các trình tự ADN độc quyền của loài này.

Tiến hành PCR

Chu trình nhiệt:

Biến tính (Denaturation): 94-95°C trong 30-60 giây.

Gắn primer (Annealing): Nhiệt độ tùy thuộc vào primer trong 30-60 giây.

Kéo dài (Extension): 72°C trong 30-60 giây.

Lắp lại chu trình trên 30-40 lần.

Phân tích kết quả

Chạy điện di gel agarose: Sử dụng gel agarose để xác định sự hiện diện của sản phẩm PCR.

Kiểm tra kết quả: Vạch ADN trên gel có kích thước phù hợp với mối dẫn là dấu hiệu dương tính với EHP.

PCR thông thường và PCR thực (qPCR)

PCR thông thường:

Được sử dụng rộng rãi, phù hợp với các phòng thí nghiệm cơ bản.

Chỉ cho phép xác định có hay không có ADN của EHP.

PCR:

Là phương pháp PCR tiến tiến cho phép định lượng ADN trong thời gian thực.

PCR giúp đánh giá độ nhiễm của EHP trong mẫu, từ đó đề xuất biện pháp xử lý thích hợp.

Đánh giá độ chính xác của PCR trong phát hiện EHP

Độ nhạy cao: PCR có thể phát hiện EHP ngay cả khi chỉ có một lượng rất nhỏ ADN trong mẫu.

Tính đặc hiệu: Primer đặc hiệu giúp tránh nhầm lẫn với các loài vi sinh khác.

Khó khăn: Để đạt kết quả chính xác, các bước chiết tách ADN và thiết lập phản ứng PCR phải được thực hiện một cách cẩn thận.

Kết luận

PCR là một công cụ quan trọng trong phát hiện và phòng ngừa Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) trong nuôi tôm. Việc ứng dụng kỹ thuật này giúp người nuôi tôm kiểm soát bệnh