Nhiệt độ cao: Bất hoạt các bào tử EHP

Nghiên cứu cho thấy các bào tử Microsporidian enterocytozoon hepatopenaei bị bất hoạt trong 1 phút ở nhiệt độ 75⁰C. Điều này có nghĩa là các phương pháp thanh trùng thông thường đã được khuyến nghị để xử lý thức ăn cho tôm là đủ để đảm bảo vô hiệu hóa EHP.

Nhiệt độ trên 75⁰C làm bất hoạt bào tử microsporidian enterocytozoon hepatopenaei trong 1 phút

Hiện tại, người ta biết rằng Enterocytozoon Hepatopenaei (EHP) rất phổ biến ở một số quốc gia ở châu Á và dẫn đến tôm chậm phát triển làm giảm năng xuất và thiệt hại cho người nuôi. Do những thiệt hại tiềm ẩn này, ngày càng có nhiều sự chú ý đến việc kiểm soát EHP, đặc biệt tập trung vào việc loại trừ EHP khỏi các ao nuôi trồng.

Các chiến lược quan trọng hiện tại là sử dụng tôm bố mẹ sạch bệnh (SPF) trong đó có EHP trong danh sách loại trừ mầm bệnh. Một cách khác là ngừng sử dụng thức ăn tươi sống cho tôm bố mẹ. Do chú ý đến khả năng có EHP trong thức ăn cho tôm bố mẹ, một số nhà điều hành trại giống và trang trại đã bắt đầu thử nghiệm thức ăn khô và thành phần của chúng để phát hiện EHP bằng phương pháp PCR và loại bỏ các sản phẩm dương tính vì có thể gây nhiễm vi bảo tử trùng EHP.

Tuy nhiên, tác giả đưa ra giả thuyết rằng thức ăn khô cho tôm đã trải qua các quy trình sản xuất bình thường gồm trộn, ép viên và sấy khô đã đạt đến nhiệt độ đủ trong một thời gian để vô hiệu hóa bất kỳ EHP nào có thể có trong thành phần thức ăn. Để kiểm tra giả thuyết này, nghiên cứu đã tiến hành các thí nghiệm trong đó các bào tử EHP có được xử lý ở 75⁰C trong 45 đến 60 giây, sau đó được sử dụng trong các xét nghiệm khả năng sống và thử nghiệm cảm nhiễm tôm để xác định tác động nhiệt đối với khả năng tồn tại của bào tử và khả năng lây nhiễm.

Vật liệu và phương pháp

Tôm bị nhiễm EHP nặng được thu thập từ các trang trại nuôi tôm ở tỉnh Pathum Thani, Thái Lan. Khi đến phòng thí nghiệm, tôm được ngâm trong nước đá trước khi loại bỏ gan tụy (HP) (cơ quan đích của EHP). Các bào tử EHP đã được tinh chế từ mẫu gan tụy đồng nhất và được bảo quản trong PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) ở nhiệt độ phòng (nhưng không quá 4 ngày) làm mẫu dự trữ cho đến khi sử dụng. Khả năng tồn tại của từng lô bào tử tinh khiết được xác định bằng xét nghiệm sợ tơ phân cực bào tử (Aldama-Cano & cs., 2018). Dịch bào tử được ủ với dung dịch Phloxine B 2% trong 10 phút ở nhiệt độ phòng (25⁰C) trước khi quan sát bằng kính hiển vi với 3 lần lặp lại để đếm số lượng bào tử nảy mầm trong tổng số 100 bào tử được quan sát.

Thử nghiệm lây nhiễm bằng phương pháp tiêm

Ba nhóm thử nghiệm (n = 6 mỗi nhóm). Nghiệm thức 1 được tiêm các bào tử không được xử lý bằng nhiệt, nghiệm thức 2 bào tử được xử lý bằng nhiệt ở 75⁰C trong 45 giây và nghiệm thức 3 bào tử được làm nóng ở 75⁰C trong 60 giây. Dịch bào tử trong 1μl (1×105 bào tử) từ nồng độ 1×10⁸ bào tử/mL đang hoạt động được pha loãng thành 50 μl PBS trước khi tiêm trực tiếp vào tôm. Sau khi tiêm, tôm được nuôi trong các bể nhựa riêng biệt chứa 30L nước muối 15ppt (Marinium™) được sục khí liên tục trong 14 ngày. Trước khi tiến hành thí nghiệm, lấy mẫu gan tụy để xác định mức độ nhiễm EHP bằng phương pháp nested PCR.

Bổ sung thức ăn với các bào tử EHP chưa được xử lý

Từ nồng độ bào tử 2×10⁸ bào tử/ml xuống nồng độ 1 μl (2×10⁵ bào tử/ml) được trộn vào thức ăn, sau đó để khô tự nhiên trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng trong các thử nghiệm cho tôm ăn. Thức ăn có bổ sung bào tử EHP được chuẩn bị mới vào buổi sáng của mỗi ngày thí nghiệm. Tỷ lệ nảy mầm của các lô bào tử đã được kiểm tra hàng ngày trước khi sử dụng để chuẩn bị thức ăn (Bảng 1) và không được sử dụng trong hơn ba ngày hoặc khi tỷ lệ phát triển dưới 30%. Lý do là để tránh các vấn đề liên quan đến việc giảm dần, hàng ngày tỷ lệ nảy mầm xảy ra đối với mỗi lô sau khi chuẩn bị (Aldama-Cano & cs., 2018). 3.

 Kết quả nghiên cứu

Nhiệt độ 750 C bất hoạt bào tử EHP trong 01 phút

Kết quả của thí nghiệm về ảnh hưởng của nhiệt độ đối với quá trình nảy mầm bào tử được thể hiện trong Bảng 1. Đối với thử nghiệm gia nhiệt thứ nhất và thứ hai ở 75⁰C trong 45 giây và 75⁰C trong 60 giây, không thấy sự phát triển bào tử EHP, trong khi bào tử không sử dụng nhiệt cho thấy sự phát triển lần lượt là 61 ± 2,0% và 77 ± 2,7%. Đối với gia nhiệt trong bể nước, quan sát thấy sự phát triển rất thấp 0,33 ± 0,58% khi xử lý ở 75⁰C trong 45 giây, và hoàn toàn không thấy hiện tượng nảy mầm bào tử sau khi gia nhiệt ở 75⁰C trong 60 giây. Nghiên cứu cho rằng sự phát triển EHP này xảy ra trong các bước chuẩn bị trước khi xử lý nhiệt. Ngược lại, sự phát triển đối với các bào tử không được gia nhiệt cao lần lượt là 71 ± 1,2% và 79 ± 1,53%.

Bảng 1. Xác định tỷ lệ nảy mầm bào tử (%) sau khi xử lý nhiệt

Các bào tử EHP được xử lý nhiệt không lây nhiễm bằng phương pháp tiêm

Trong các thí nghiệm về khả năng lây nhiễm của bào tử EHP được xử lý nhiệt bằng phương pháp tiêm, 2 con tôm chết trong nhóm tiêm bào tử không được xử lý nhiệt, 3 trong số 4 con tôm còn lại cho kết quả PCR dương tính với EHP. Ngược lại, hai nhóm nghiệm thức được tiêm bào tử được làm nóng ở 75⁰C trong 45 giây hoặc 60 giây (n = 6 + 6 = 12) đều cho kết quả PCR âm tính. Kết quả chỉ ra rằng các bào tử được làm nóng không có khả năng gây bệnh EHP.

Trong nghiên cứu này, bào tử EHP được phát hiện là bất hoạt trong thời gian ngắn (1 phút) ở 75⁰C. Điều quan trọng cần nhấn mạnh là việc đếm thời gian tiếp xúc với nhiệt không được bắt đầu cho đến khi dịch bào tử đạt đến 75⁰C. Do đó, việc xử lý nhiệt của các lô lớn thức ăn chăn nuôi hoặc thành phần thức ăn chăn nuôi sẽ cần phải được điều chỉnh để đảm bảo rằng nhiệt độ gia nhiệt lõi sẽ đạt 75⁰C trong ít nhất 1 phút. Do đó, tổng thời gian gia nhiệt sẽ thay đổi tùy thuộc vào số lượng và hình thức chất nền.

Thức ăn nuôi tôm thương phẩm dương tính với EHP-PCR không lây nhiễm

Vào ngày 14, 3 mẫu tôm được lấy từ mỗi nhóm trong số 4 nhóm thử nghiệm để kiểm tra sự hiện diện của EHP trong gan tụy của tôm bằng giám định PCR. Cả 3 mẫu từ nhóm 1 đối chứng dương tính được cho ăn thức ăn có bổ sung bào tử EHP hoạt động đều cho kết quả PCR dương tính với EHP (Hình 1). Ngược lại, 3 mẫu tôm từ nhóm đối chứng âm tính 2 và hai nhóm thức ăn công nghiệp 3 và 4 (dương tính với EHP bằng PCR) cũng cho kết quả PCR âm tính với EHP (Hình 1). Do đó, người ta đã quyết định kéo dài thời gian cho ăn thêm 7 ngày để tạo thêm cơ hội lây nhiễm từ thức ăn công nghiệp.

Hình 1. Kết quả PCR xét nghiệm EHP trên tôm ở 14 ngày tuổi trong thí nghiệm

Trong thời gian kéo dài từ ngày 15–21 (7 con trong mỗi nhóm thử nghiệm), hai con tôm (lột xác trước, vỏ mềm) đã chết ở nhóm 3 được cho ăn bằng thức ăn công nghiệp CS1. Do đó, sau khi thí nghiệm kết thúc vào ngày 21, 5 con tôm còn lại từ nhóm 3 và 5 con tôm được chọn tùy ý từ 7 con tôm còn lại trong 3 nhóm còn lại đã được xét nghiệm EHP bằng PCR. Tất cả 5 con tôm từ nhóm 1 đối chứng dương tính đều cho kết quả dương tính với EHP, trong khi tất cả 5 con tôm ở mỗi nhóm trong số ba nhóm còn lại (tổng cộng 15 con) đều cho kết quả âm tính với EHP bằng PCR (Hình 2).

Hình 2. Kết quả PCR xét nghiệm EHP trên tôm ở 21 ngày trong thí nghiệm

Tóm lại, trong số 8 con tôm được xét nghiệm ở mỗi nhóm trong số 4 nhóm tôm bằng phương pháp PCR vào ngày 14 (mỗi con 3 mẫu) và ngày 21 (mỗi con 5 mẫu), 6 con tôm trong nhóm đối chứng dương tính đã cho kết quả dương tính với EHP bằng PCR trong khi EHP là không thể phát hiện được ở 8 con tôm từ mỗi nhóm trong số 3 nhóm thử nghiệm còn lại (3 × 8 = 24 con tôm).

Kết luận

Nghiên cứu cho thấy các bào tử EHP bị bất hoạt với nhiệt độ ở 75⁰C trong một phút. Điều này có nghĩa là các phương pháp thanh trùng thông thường đã được khuyến nghị để xử lý thức ăn cho tôm là đủ để đảm bảo vô hiệu hóa EHP. Tuy nhiên, có khả năng những loại thức ăn như vậy sẽ cho kết quả xét nghiệm PCR dương tính nếu chúng chứa DNA của EHP. Điều này có thể xảy ra do các thành phần thức ăn nuôi tôm thường bao gồm động vật biển hoặc các sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất của chúng. Vì vậy, điều quan trọng là phải chấp nhận rằng việc sử dụng PCR hoặc các phương pháp phân tử khác để sàng lọc EHP trong thức ăn nuôi tôm sản xuất là không phù hợp như một phương pháp để xác định nguy cơ lây truyền EHP. Thay vào đó, bằng chứng cho thấy thức ăn hoặc thành phần của chúng đã được làm nóng để đạt đến nhiệt độ cốt lõi là 75⁰C hoặc cao hơn trong ít nhất 1 phút trong quá trình sản xuất nên là tiêu chí sàng lọc duy nhất về độ an toàn.